viernes, 2 de mayo de 2008

IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES DEL PROPÓLEO RECOLECTADO POR Apis mellifera L. y Melipona beecheii B. EN EL ESTADO DE YUCATÁN.

Dra. María América Delgado Herrera[1], M. en C. Luís Roberto Martínez2, M. en C. Rafael Casillas Peñuelas3, Dra. Elda María Quijano Cervera1, M. en C. José R. López Cetz1, Dr. Enrique Sauri Duch4, M. en C. Israel Alexandro Pérez Martínez1

RESUMEN
En el Estado de Yucatán la actividad apícola comercial utiliza abejas del género Apis mellifera para su explotación, sin embargo, en algunas zonas del estado se realiza la crianza de abejas nativas del género Melipona beecheii B. La abeja Melipona beecheii B. ha sido utilizada desde la época prehispánica por los campesinos mayas de la Península de Yucatán. La meliponicultura ha decrecido paulatinamente en nuestro estado debido a que esta abeja produce cantidades de miel muy pequeñas. Por lo que la apicultura local se ha evocado más a la cría de abejas Apis mellifera L. Los apicultores están más enfocados a la producción de miel, pero también existen algunos que se han preocupado por la recolección de otros productos de la colmena, entre ellos, el propóleo, que es una resina compuesta de cera y exudados resinosos de ramas, hojas y yemas de los árboles. El propóleo de la especie Apis mellifera ha sido reconocido en países como Cuba, Brasil y Argentina por las propiedades biológicas que posee (antibacteriana, antifúngica, antioxidante, cicatrizante, regeneradoras de tejidos, entre otras). Los aceites esenciales del propóleo son de mucha importancia, a pesar de que se encuentran en bajas concentraciones (0.2- 2.2 % del total de la muestra) se sabe que le confieren actividad antimicrobiana. En el presente trabajo, se identificaron los compuestos volátiles que forman parte del Propóleo recolectado por abejas meliferas y nativas en el estado de Yucatán. La obtención del concentrado volátil se realizó por el método Likens y Nickerson. La separación de los compuestos volátiles de los extractos se realizó en un cromatógrafo de gases HP-6890N, acoplado a un detector másico selectivo 5973, su identificación fue a través de los espectros de masas, comparándolos con la base de datos NBS y NIST/EPA/NIH 75K. Se identificaron 99 y 90 compuestos volátiles del extracto obtenido de Apis mellifera L. y Melipona beecheii B, respectivamente. Entre los compuestos identificados en el aceite esencial, se encontraron el α-pineno, limoneno, b-pineno, trans-verbenol, a-copaeno, b-bourboneno, b-cariofileno, espatulenol y oxido de cariofileno como mayoritarios del propóleo de ambas abejas, sin embargo, se detectaron en mayor concentración en el propóleo de abejas nativas.
PALABRAS CLAVES: Propóleo, meliponas, Apis, volátiles, aceite esencial.
INTRODUCCIÓN

La producción y exportación de miel es una actividad económica importante en el estado de Yucatán, sirviendo como una fuente de ingresos adicionales para los campesinos y generadora de divisas en el estado. Actualmente la apicultura tiene únicamente a la miel como producto primario y sólo un grupo reducido de apicultores (menos del 10 %) cosechan polen o jalea Real y ninguno de estos colectan propóleo, a pesar de la posibilidad de aprovechar estos productos con alto potencial económico (1).

El propóleo que recolectan las abejas en el estado de Yucatán no está siendo aprovechado, ya que no existen técnicas descritas sobre su recolección, tratamiento, procesamiento y almacenaje; además de un estudio que indique su calidad. Para establecer estándares de calidad adecuados es necesario cuantificar algún compuesto químico que permita su comparación con diferentes tipos de propóleos. El problema que presenta su estudio y comparación, es que cada tipo de propóleo varía de acuerdo a su ubicación geográfica (1,2)

El propóleo ha cobrado gran relevancia en los últimos años, por ser una sustancia natural usada en medicina y cosméticos, lo que incrementó su demanda en el mercado mundial debido a sus propiedades antimicrobianas, antioxidantes, antimicóticos, antiinflamatorias, cicatrizantes; así como sus acciones antiparasitarias, inmunoestimulantes, antivirales y antisépticas, entre otras (3,4). Cada país dedicado a la producción de propóleo reporta diferentes normas y especificaciones de calidad, siendo los países compradores y los productores, los que han establecido la mayoría de ellas. Los compuestos fenólicos son los más importantes cuantitativamente por su valor farmacológico; sin embargo, los compuestos volátiles también son relevantes debido a las propiedades antibacterianas que poseen. (5,6). Estos compuestos se encuentran en bajas concentraciones y se han reportado fenoles, esteres, terpenoides y sesquiterpenos como el espatulenol, isoespatulenol, palustrol y ledene (7).

MATERIAL Y MÉTODOS

La recolección del propóleo se realizó en la región sureste de México, en el estado de Yucatán, durante un año. Para tal fin se utilizaron mallas de plástico, de 41 cm de ancho por 51 cm de largo, con orificios de 3x3 mm; éstas se colocaron en la parte superior de la última alza de la colmena de la especie Apis mellifera. Las mallas propolizadas se retiraron de la colmena, se llevaron al laboratorio y el propóleo se separó de las mallas para su análisis. El propóleo de M. beecheii se raspó directamente de la colmena con ayuda de una espátula de acero, el propóleo raspado se transportó al laboratorio en frascos ámbar para su posterior análisis.

La obtención de los compuestos volátiles se realizó con el equipo Likens y Nickerson (8) en el que se suspendieron 200 g de propóleo de cada especie de abejas en 600 mL de agua destilada y se utilizó como disolvente para la extracción 30 mL de diclorometano (DCM) grado cromatográfico, en el equipo la muestra se destiló y extrajo simultáneamente durante 60 minutos y una vez concluida la destilación, se eliminó el exceso de agua de la fase orgánica, utilizando sulfato de sodio anhidro, se concentró el extracto orgánico con la ayuda de un rotavapor, obteniéndose el concentrado volátil de apariencia aceitosa. La separación de los compuestos volátiles se realizó en un cromatógrafo de gases.

Para la separación de los principales constituyentes de la muestra se utilizó un cromatógrafo de gases (CG) Hewlett Packard modelo 6890N, acoplado a un detector másico selectivo 5973 (Agilent Technologies USA) con un software Hewlett Packard Chemstation. La columna fue capilar de 30 m de longitud y 0.25 mm de diámetro interno con una fase estacionaria de 5%-difenil-95% dimetil siloxano, espesor de película de 0.2 μm. Las condiciones de operación fueron: temperatura inicial del horno fue de 60 ºC con incrementos de 6 ºC por minuto hasta 280 ºC y con incrementos de 30 ºC por minuto hasta una temperatura final de 310 ºC. El volumen de inyección fue de 0.5μl; se utilizó helio como gas acarreador (con una presión interna de 50.8 KPa) con velocidad lineal de 35 cm/seg y con flujo de 0.925 ml/min. La temperatura del inyector se programó a 250 ºC. El tiempo de corrida fue de 45 minutos. La inyección fue con división (split). La identificación de los compuestos volátiles fue a través de sus espectros de masas comparándolos con la base de datos NIST/EPA/NIH 75K, los índices de retención fueron calculados contra los de n-parafina (índices de kovats) y la cuantificación de los compuestos se realizó por medio de un integrador electrónico (EZChrom v6.7 software) de las áreas bajo la curva de los espectros del CG.

RESULTADOS

El análisis cromatográfico permitió la identificación de los compuestos volátiles del propóleo. En el cuadro 1, se presentan los 99 compuestos volátiles identificados en el propóleo de A. mellifera, su tiempo de retención (TR) y concentración en mg/kg; en el cuadro 2 se reportan los mismos parámetros para los 90 volátiles encontrados en el propóleo de M. beecheii; en ambos estudios se reveló la presencia de terpenos oxigenados, considerados la parte más importante de los aceites esenciales, puesto que son los responsables de los olores, sabores y propiedades terapéuticas, la mayoría de estos compuestos se encontraron en mayor concentración en el propóleo de abejas nativas.

Gran número de los compuestos identificados ya han sido reportados en propóleos de otras partes del mundo. El espatulenol y trans carveol han sido reportados anteriormente en estudios realizados con muestras procedentes de Brasil; el b-eudesmol ha sido identificado en muestras colectadas en regiones con clima templado como el propóleo proveniente de Bulgaria.

Con referencia al espatulenol, investigaciones recientes señalan a la especie Baccharis como posible vegetación utilizada por las abejas para la obtención de propóleo; ya que, de siete especies de Baccharis analizadas, cuatro contenían espatulenol como principal componente del aceite esencial (9).

Otros compuestos que han sido identificados anteriormente son el aldehído a-camfoleno, d-cadineno, mirtenol, manol, oxido de manol, b-eudesmol; reportados en muestras colectadas en los estados de Jalisco y colima (10).

Del α-bisabolol y el cipereno, no se tienen reportes, hasta ahora, de su presencia en propóleos de otras partes.

Los compuestos volátiles mayoritarios fueron a-pineno, limoneno, trans-verbenol, verbebona y cariofileno, los cuales también han sido reportados anteriormente en propóleo y poseen una alta actividad antimicrobiana contra microorganismos gram negativos (9,11).
Dra. María América Delgado Herrera[1], M. en C. Luís Roberto Martínez2, M. en C. Rafael Casillas Peñuelas3, Dra. Elda María Quijano Cervera1, M. en C. José R. López Cetz1, Dr. Enrique Sauri Duch4, M. en C. Israel Alexandro Pérez Martínez1
RESUMEN
En el Estado de Yucatán la actividad apícola comercial utiliza abejas del género Apis mellifera para su explotación, sin embargo, en algunas zonas del estado se realiza la crianza de abejas nativas del género Melipona beecheii B. La abeja Melipona beecheii B. ha sido utilizada desde la época prehispánica por los campesinos mayas de la Península de Yucatán. La meliponicultura ha decrecido paulatinamente en nuestro estado debido a que esta abeja produce cantidades de miel muy pequeñas. Por lo que la apicultura local se ha evocado más a la cría de abejas Apis mellifera L. Los apicultores están más enfocados a la producción de miel, pero también existen algunos que se han preocupado por la recolección de otros productos de la colmena, entre ellos, el propóleo, que es una resina compuesta de cera y exudados resinosos de ramas, hojas y yemas de los árboles. El propóleo de la especie Apis mellifera ha sido reconocido en países como Cuba, Brasil y Argentina por las propiedades biológicas que posee (antibacteriana, antifúngica, antioxidante, cicatrizante, regeneradoras de tejidos, entre otras). Los aceites esenciales del propóleo son de mucha importancia, a pesar de que se encuentran en bajas concentraciones (0.2- 2.2 % del total de la muestra) se sabe que le confieren actividad antimicrobiana. En el presente trabajo, se identificaron los compuestos volátiles que forman parte del Propóleo recolectado por abejas meliferas y nativas en el estado de Yucatán. La obtención del concentrado volátil se realizó por el método Likens y Nickerson. La separación de los compuestos volátiles de los extractos se realizó en un cromatógrafo de gases HP-6890N, acoplado a un detector másico selectivo 5973, su identificación fue a través de los espectros de masas, comparándolos con la base de datos NBS y NIST/EPA/NIH 75K. Se identificaron 99 y 90 compuestos volátiles del extracto obtenido de Apis mellifera L. y Melipona beecheii B, respectivamente. Entre los compuestos identificados en el aceite esencial, se encontraron el α-pineno, limoneno, b-pineno, trans-verbenol, a-copaeno, b-bourboneno, b-cariofileno, espatulenol y oxido de cariofileno como mayoritarios del propóleo de ambas abejas, sin embargo, se detectaron en mayor concentración en el propóleo de abejas nativas.
PALABRAS CLAVES: Propóleo, meliponas, Apis, volátiles, aceite esencial.
INTRODUCCIÓN

La producción y exportación de miel es una actividad económica importante en el estado de Yucatán, sirviendo como una fuente de ingresos adicionales para los campesinos y generadora de divisas en el estado. Actualmente la apicultura tiene únicamente a la miel como producto primario y sólo un grupo reducido de apicultores (menos del 10 %) cosechan polen o jalea Real y ninguno de estos colectan propóleo, a pesar de la posibilidad de aprovechar estos productos con alto potencial económico (1).

El propóleo que recolectan las abejas en el estado de Yucatán no está siendo aprovechado, ya que no existen técnicas descritas sobre su recolección, tratamiento, procesamiento y almacenaje; además de un estudio que indique su calidad. Para establecer estándares de calidad adecuados es necesario cuantificar algún compuesto químico que permita su comparación con diferentes tipos de propóleos. El problema que presenta su estudio y comparación, es que cada tipo de propóleo varía de acuerdo a su ubicación geográfica (1,2)

El propóleo ha cobrado gran relevancia en los últimos años, por ser una sustancia natural usada en medicina y cosméticos, lo que incrementó su demanda en el mercado mundial debido a sus propiedades antimicrobianas, antioxidantes, antimicóticos, antiinflamatorias, cicatrizantes; así como sus acciones antiparasitarias, inmunoestimulantes, antivirales y antisépticas, entre otras (3,4). Cada país dedicado a la producción de propóleo reporta diferentes normas y especificaciones de calidad, siendo los países compradores y los productores, los que han establecido la mayoría de ellas. Los compuestos fenólicos son los más importantes cuantitativamente por su valor farmacológico; sin embargo, los compuestos volátiles también son relevantes debido a las propiedades antibacterianas que poseen. (5,6). Estos compuestos se encuentran en bajas concentraciones y se han reportado fenoles, esteres, terpenoides y sesquiterpenos como el espatulenol, isoespatulenol, palustrol y ledene (7).

MATERIAL Y MÉTODOS

La recolección del propóleo se realizó en la región sureste de México, en el estado de Yucatán, durante un año. Para tal fin se utilizaron mallas de plástico, de 41 cm de ancho por 51 cm de largo, con orificios de 3x3 mm; éstas se colocaron en la parte superior de la última alza de la colmena de la especie Apis mellifera. Las mallas propolizadas se retiraron de la colmena, se llevaron al laboratorio y el propóleo se separó de las mallas para su análisis. El propóleo de M. beecheii se raspó directamente de la colmena con ayuda de una espátula de acero, el propóleo raspado se transportó al laboratorio en frascos ámbar para su posterior análisis.

La obtención de los compuestos volátiles se realizó con el equipo Likens y Nickerson (8) en el que se suspendieron 200 g de propóleo de cada especie de abejas en 600 mL de agua destilada y se utilizó como disolvente para la extracción 30 mL de diclorometano (DCM) grado cromatográfico, en el equipo la muestra se destiló y extrajo simultáneamente durante 60 minutos y una vez concluida la destilación, se eliminó el exceso de agua de la fase orgánica, utilizando sulfato de sodio anhidro, se concentró el extracto orgánico con la ayuda de un rotavapor, obteniéndose el concentrado volátil de apariencia aceitosa. La separación de los compuestos volátiles se realizó en un cromatógrafo de gases.

Para la separación de los principales constituyentes de la muestra se utilizó un cromatógrafo de gases (CG) Hewlett Packard modelo 6890N, acoplado a un detector másico selectivo 5973 (Agilent Technologies USA) con un software Hewlett Packard Chemstation. La columna fue capilar de 30 m de longitud y 0.25 mm de diámetro interno con una fase estacionaria de 5%-difenil-95% dimetil siloxano, espesor de película de 0.2 μm. Las condiciones de operación fueron: temperatura inicial del horno fue de 60 ºC con incrementos de 6 ºC por minuto hasta 280 ºC y con incrementos de 30 ºC por minuto hasta una temperatura final de 310 ºC. El volumen de inyección fue de 0.5μl; se utilizó helio como gas acarreador (con una presión interna de 50.8 KPa) con velocidad lineal de 35 cm/seg y con flujo de 0.925 ml/min. La temperatura del inyector se programó a 250 ºC. El tiempo de corrida fue de 45 minutos. La inyección fue con división (split). La identificación de los compuestos volátiles fue a través de sus espectros de masas comparándolos con la base de datos NIST/EPA/NIH 75K, los índices de retención fueron calculados contra los de n-parafina (índices de kovats) y la cuantificación de los compuestos se realizó por medio de un integrador electrónico (EZChrom v6.7 software) de las áreas bajo la curva de los espectros del CG.

RESULTADOS
El análisis cromatográfico permitió la identificación de los compuestos volátiles del propóleo. En el cuadro 1, se presentan los 99 compuestos volátiles identificados en el propóleo de A. mellifera, su tiempo de retención (TR) y concentración en mg/kg; en el cuadro 2 se reportan los mismos parámetros para los 90 volátiles encontrados en el propóleo de M. beecheii; en ambos estudios se reveló la presencia de terpenos oxigenados, considerados la parte más importante de los aceites esenciales, puesto que son los responsables de los olores, sabores y propiedades terapéuticas, la mayoría de estos compuestos se encontraron en mayor concentración en el propóleo de abejas nativas.

Gran número de los compuestos identificados ya han sido reportados en propóleos de otras partes del mundo. El espatulenol y trans carveol han sido reportados anteriormente en estudios realizados con muestras procedentes de Brasil; el b-eudesmol ha sido identificado en muestras colectadas en regiones con clima templado como el propóleo proveniente de Bulgaria.

Con referencia al espatulenol, investigaciones recientes señalan a la especie Baccharis como posible vegetación utilizada por las abejas para la obtención de propóleo; ya que, de siete especies de Baccharis analizadas, cuatro contenían espatulenol como principal componente del aceite esencial (9).

Otros compuestos que han sido identificados anteriormente son el aldehído a-camfoleno, d-cadineno, mirtenol, manol, oxido de manol, b-eudesmol; reportados en muestras colectadas en los estados de Jalisco y colima (10).

Del α-bisabolol y el cipereno, no se tienen reportes, hasta ahora, de su presencia en propóleos de otras partes.

Los compuestos volátiles mayoritarios fueron a-pineno, limoneno, trans-verbenol, verbebona y cariofileno, los cuales también han sido reportados anteriormente en propóleo y poseen una alta actividad antimicrobiana contra microorganismos gram negativos (9,11).
CONCLUSIONES
Los compuestos volátiles identificados en el propóleo fueron similares a los reportados en países como Brasil y Argentina, que son los líderes en producción de propóleos de América.

Los compuestos volátiles mayoritarios en ambos propóleos poseen una marcada actividad antimicrobiana contra microorganismos patógenos, que le aportan propiedades terapéuticas relevantes, además que su concentración en el propóleo de abejas nativas es mayor que el de las abejas melíferas.

LITERATURA CITADA
Echazarreta, C. M. ; Quezada-Euán, J. J. G.; Medina, L.; Pasteur, K. L. (1997) Beekeeping in the Yucatan peninsula: development and current status. World 78(3):115-127.
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Aceves, T. Resumen de Investigación: Características químicas del propóleo de tres localidades comprendidas en los estados de Jalisco y Colima. 1998. Universidad Autónoma de Guadalajara.
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[1]1Facultad de Química, Universidad Autónoma de Yucatán.
2Universidad Autónoma de Campeche
3Universidad Autónoma de Aguas Calientes
4Instituto Tecnológico de Mérida

1 comentario:

Cristian dijo...

Hola, queria saber si va a haber algun nuevo seminario o Congreso en los próximos meses en algun hotel en mazatlán o en algun centro de convenciones porque queria participar de algunas charlas. Gracias